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Na última década, a tecnologia de sequenciamento genético tem sido amplamente utilizada na pesquisa e na prática clínica do câncer, tornando-se uma ferramenta importante para revelar as características moleculares do câncer. Avanços no diagnóstico molecular e na terapia direcionada promoveram o desenvolvimento de conceitos de terapia de precisão tumoral e trouxeram grandes mudanças para todo o campo do diagnóstico e tratamento de tumores. Os testes genéticos podem ser usados ​​para alertar sobre o risco de câncer, orientar decisões de tratamento e avaliar o prognóstico, sendo uma ferramenta importante para melhorar os desfechos clínicos dos pacientes. Aqui, resumimos os artigos recentes publicados no CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol e outros periódicos para revisar a aplicação dos testes genéticos no diagnóstico e tratamento do câncer.

Mutações somáticas e mutações da linha germinativa. Em geral, o câncer é causado por mutações de DNA que podem ser herdadas dos pais (mutações da linha germinativa) ou adquiridas com a idade (mutações somáticas). Mutações da linha germinativa estão presentes desde o nascimento, e o mutador geralmente carrega a mutação no DNA de todas as células do corpo e pode ser transmitido aos descendentes. Mutações somáticas são adquiridas por indivíduos em células não gaméticas e geralmente não são transmitidas aos descendentes. Tanto as mutações da linha germinativa quanto as somáticas podem destruir a atividade funcional normal das células e levar à transformação maligna das células. Mutações somáticas são um fator-chave de malignidade e o biomarcador mais preditivo em oncologia; no entanto, aproximadamente 10 a 20% dos pacientes com tumor são portadores de mutações da linha germinativa que aumentam significativamente o risco de câncer, e algumas dessas mutações também são terapêuticas.
Mutação condutora e mutação passageira. Nem todas as variantes de DNA afetam a função celular; em média, são necessários de cinco a dez eventos genômicos, conhecidos como "mutações condutoras", para desencadear a degeneração celular normal. Mutações condutoras frequentemente ocorrem em genes intimamente relacionados às atividades da vida celular, como genes envolvidos na regulação do crescimento celular, reparo de DNA, controle do ciclo celular e outros processos vitais, e têm o potencial de serem usadas como alvos terapêuticos. No entanto, o número total de mutações em qualquer câncer é bastante grande, variando de alguns milhares em alguns cânceres de mama a mais de 100.000 em alguns cânceres colorretais e endometriais altamente variáveis. A maioria das mutações não tem significância biológica ou tem significância biológica limitada; mesmo que a mutação ocorra na região codificadora, esses eventos mutacionais insignificantes são chamados de "mutações passageiras". Se uma variante genética em um tipo específico de tumor prevê sua resposta ou resistência ao tratamento, a variante é considerada clinicamente operável.
Oncogenes e genes supressores de tumor. Os genes que sofrem mutações frequentes no câncer podem ser divididos em duas categorias: oncogenes e genes supressores de tumor. Em células normais, a proteína codificada pelos oncogenes desempenha principalmente o papel de promover a proliferação celular e inibir a apoptose celular, enquanto a proteína codificada pelos genes oncossupressores é a principal responsável por regular negativamente a divisão celular para manter a função celular normal. No processo de transformação maligna, a mutação genômica leva ao aumento da atividade do oncogene e à diminuição ou perda da atividade do gene oncossupressor.
Pequena variação e variação estrutural. Estes são os dois principais tipos de mutações no genoma. Pequenas variantes alteram o DNA mudando, deletando ou adicionando um pequeno número de bases, incluindo inserção de base, deleção, mudança de quadro, perda de códon inicial, mutações de perda de códon final, etc. A variação estrutural é um grande rearranjo do genoma, envolvendo segmentos de genes que variam em tamanho de alguns milhares de bases até a maioria do cromossomo, incluindo mudanças no número de cópias do gene, deleção, duplicação, inversão ou translocação do cromossomo. Essas mutações podem causar uma redução ou aumento da função da proteína. Além das mudanças no nível de genes individuais, as assinaturas genômicas também fazem parte dos relatórios de sequenciamento clínico. As assinaturas genômicas podem ser vistas como padrões complexos de pequenas e/ou variações estruturais, incluindo carga de mutação tumoral (TMB), instabilidade de microssatélites (MSI) e defeitos de recombinação homóloga.

Mutação clonal e mutação subclonal. Mutações clonais estão presentes em todas as células tumorais, estão presentes no diagnóstico e permanecem presentes após o avanço do tratamento. Portanto, mutações clonais têm o potencial de serem usadas como alvos terapêuticos tumorais. Mutações subclonais estão presentes em apenas um subconjunto de células cancerígenas e podem ser detectadas no início do diagnóstico, mas desaparecem com a recorrência subsequente ou aparecem somente após o tratamento. A heterogeneidade do câncer refere-se à presença de múltiplas mutações subclonais em um único câncer. Notavelmente, a grande maioria das mutações driver clinicamente significativas em todas as espécies comuns de câncer são mutações clonais e permanecem estáveis ​​ao longo da progressão do câncer. A resistência, que é frequentemente mediada por subclones, pode não ser detectada no momento do diagnóstico, mas aparece quando recidiva após o tratamento.

A técnica tradicional de FISH, ou cariótipo celular, é utilizada para detectar alterações em nível cromossômico. A FISH pode ser utilizada para detectar fusões, deleções e amplificações gênicas, sendo considerada o "padrão ouro" para a detecção dessas variantes, com alta precisão e sensibilidade, mas com rendimento limitado. Em algumas neoplasias hematológicas, especialmente a leucemia aguda, a cariótipo ainda é utilizada para orientar o diagnóstico e o prognóstico, mas essa técnica está sendo gradualmente substituída por ensaios moleculares direcionados, como FISH, WGS e NGS.
Alterações em genes individuais podem ser detectadas por PCR, tanto em tempo real quanto por PCR digital. Essas técnicas apresentam alta sensibilidade, são particularmente adequadas para a detecção e o monitoramento de pequenas lesões residuais e podem obter resultados em um tempo relativamente curto. A desvantagem é que o alcance da detecção é limitado (geralmente detecta apenas mutações em um ou poucos genes) e a capacidade de realizar múltiplos testes também é limitada.
A imuno-histoquímica (IHQ) é uma ferramenta de monitoramento baseada em proteínas comumente usada para detectar a expressão de biomarcadores como ERBB2 (HER2) e receptores de estrogênio. A IHQ também pode ser usada para detectar proteínas mutadas específicas (como BRAF V600E) e fusões gênicas específicas (como fusões ALK). A vantagem da IHQ é que ela pode ser facilmente integrada ao processo de análise de tecidos de rotina, podendo ser combinada com outros testes. Além disso, a IHQ pode fornecer informações sobre a localização de proteínas subcelulares. As desvantagens são a escalabilidade limitada e as altas demandas organizacionais.
Sequenciamento de segunda geração (NGS): O NGS utiliza técnicas de sequenciamento paralelo de alto rendimento para detectar variações no nível de DNA e/ou RNA. Essa técnica pode ser usada para sequenciar tanto o genoma completo (WGS) quanto as regiões gênicas de interesse. O WGS fornece as informações mais abrangentes sobre mutações genômicas, mas existem muitos obstáculos à sua aplicação clínica, incluindo a necessidade de amostras frescas de tecido tumoral (o WGS ainda não é adequado para a análise de amostras imobilizadas em formalina) e o alto custo.
O sequenciamento NGS direcionado inclui o sequenciamento completo do éxon e o painel de genes-alvo. Esses testes enriquecem regiões de interesse por meio de sondas de DNA ou amplificação por PCR, limitando assim a quantidade de sequenciamento necessária (o exoma completo compõe de 1 a 2% do genoma, e mesmo grandes painéis contendo 500 genes compõem apenas 0,1% do genoma). Embora o sequenciamento completo do éxon tenha um bom desempenho em tecidos fixados em formalina, seu custo permanece alto. As combinações de genes-alvo são relativamente econômicas e permitem flexibilidade na seleção dos genes a serem testados. Além disso, o DNA livre circulante (cfDNA) está emergindo como uma nova opção para análise genômica de pacientes com câncer, conhecido como biópsias líquidas. Tanto as células cancerígenas quanto as células normais podem liberar DNA na corrente sanguínea, e o DNA liberado pelas células cancerígenas é chamado de DNA tumoral circulante (ctDNA), que pode ser analisado para detectar potenciais mutações em células tumorais.
A escolha do teste depende do problema clínico específico a ser abordado. A maioria dos biomarcadores associados a terapias aprovadas pode ser detectada pelas técnicas de FISH, IHQ e PCR. Esses métodos são razoáveis ​​para a detecção de pequenas quantidades de biomarcadores, mas não melhoram a eficiência da detecção com o aumento da produtividade e, se muitos biomarcadores forem detectados, pode não haver tecido suficiente para a detecção. Em alguns tipos específicos de câncer, como o câncer de pulmão, onde amostras de tecido são difíceis de obter e há múltiplos biomarcadores para testar, o uso de NGS é uma escolha melhor. Em conclusão, a escolha do ensaio depende do número de biomarcadores a serem testados para cada paciente e do número de pacientes a serem testados para o biomarcador. Em alguns casos, o uso de IHQ/FISH é suficiente, especialmente quando o alvo foi identificado, como na detecção de receptores de estrogênio, receptores de progesterona e ERBB2 em pacientes com câncer de mama. Se uma exploração mais abrangente de mutações genômicas e a busca por potenciais alvos terapêuticos forem necessárias, o NGS é mais organizado e econômico. Além disso, a NGS pode ser considerada em casos em que os resultados do IHC/FISH são ambíguos ou inconclusivos.

Diferentes diretrizes orientam quais pacientes devem ser elegíveis para testes genéticos. Em 2020, o Grupo de Trabalho de Medicina de Precisão da ESMO emitiu as primeiras recomendações de testes de NGS para pacientes com câncer avançado, recomendando testes de NGS de rotina para amostras de tumores avançados de câncer de pulmão não escamoso de células não pequenas, câncer de próstata, câncer colorretal, câncer de ducto biliar e câncer de ovário. Em 2024, a ESMO atualizou essas recomendações, recomendando a inclusão de câncer de mama e tumores raros, como tumores estromais gastrointestinais, sarcomas, cânceres de tireoide e cânceres de origem desconhecida.
Em 2022, o Parecer Clínico da ASCO sobre testes de genoma somático em pacientes com câncer metastático ou avançado afirma que, se uma terapia relacionada a biomarcadores for aprovada em pacientes com tumores sólidos metastáticos ou avançados, o teste genético é recomendado para esses pacientes. Por exemplo, o teste genômico deve ser realizado em pacientes com melanoma metastático para rastrear mutações BRAF V600E, já que os inibidores de RAF e MEK são aprovados para essa indicação. Além disso, o teste genético também deve ser realizado se houver um marcador claro de resistência ao medicamento a ser administrado ao paciente. O Egfrmab, por exemplo, é ineficaz no câncer colorretal com mutação KRAS. Ao considerar a adequação de um paciente para sequenciamento genético, o estado físico, as comorbidades e o estágio do tumor do paciente devem ser integrados, porque a série de etapas necessárias para o sequenciamento do genoma, incluindo o consentimento do paciente, o processamento laboratorial e a análise dos resultados do sequenciamento, exigem que o paciente tenha capacidade física e expectativa de vida adequadas.
Além de mutações somáticas, alguns tipos de câncer também devem ser testados para genes da linha germinativa. O teste para mutações da linha germinativa pode influenciar as decisões de tratamento para cânceres como as mutações BRCA1 e BRCA2 em cânceres de mama, ovário, próstata e pâncreas. Mutações da linha germinativa também podem ter implicações para o rastreamento e prevenção futuros do câncer em pacientes. Pacientes potencialmente adequados para o teste de mutações da linha germinativa precisam atender a certas condições, que envolvem fatores como histórico familiar de câncer, idade no diagnóstico e tipo de câncer. No entanto, muitos pacientes (até 50%) portadores de mutações patogênicas na linha germinativa não atendem aos critérios tradicionais para teste de mutações da linha germinativa com base no histórico familiar. Portanto, para maximizar a identificação de portadores de mutações, a National Comprehensive Cancer Network (NCCN) recomenda que todos ou a maioria dos pacientes com câncer de mama, ovário, endométrio, pâncreas, colorretal ou de próstata sejam testados para mutações da linha germinativa.
Em relação ao momento da realização do teste genético, como a grande maioria das mutações condutoras clinicamente significativas são clonais e relativamente estáveis ​​ao longo da progressão do câncer, é razoável realizar testes genéticos em pacientes no momento do diagnóstico de câncer avançado. Para testes genéticos subsequentes, especialmente após terapia molecular direcionada, o teste de ctDNA é mais vantajoso do que o teste de DNA do tecido tumoral, pois o DNA sanguíneo pode conter DNA de todas as lesões tumorais, o que é mais propício à obtenção de informações sobre a heterogeneidade do tumor.
A análise do ctDNA após o tratamento pode ser capaz de prever a resposta do tumor ao tratamento e identificar a progressão da doença mais precocemente do que os métodos de imagem padrão. No entanto, protocolos para o uso desses dados para orientar as decisões de tratamento não foram estabelecidos, e a análise do ctDNA não é recomendada, exceto em ensaios clínicos. O ctDNA também pode ser usado para avaliar pequenas lesões residuais após cirurgia radical do tumor. O teste de ctDNA após a cirurgia é um forte preditor da progressão subsequente da doença e pode ajudar a determinar se um paciente se beneficiará da quimioterapia adjuvante, mas ainda não é recomendado o uso do ctDNA fora de ensaios clínicos para orientar as decisões de quimioterapia adjuvante.

Processamento de dados: O primeiro passo no sequenciamento do genoma é extrair DNA de amostras de pacientes, preparar bibliotecas e gerar dados brutos de sequenciamento. Os dados brutos requerem processamento adicional, incluindo a filtragem de dados de baixa qualidade, sua comparação com o genoma de referência, a identificação de diferentes tipos de mutações por meio de diferentes algoritmos analíticos, a determinação do efeito dessas mutações na tradução de proteínas e a filtragem de mutações na linha germinativa.
A anotação do gene driver foi projetada para distinguir mutações driver e passageiras. Mutações driver levam à perda ou ao aumento da atividade do gene supressor tumoral. Pequenas variantes que levam à inativação de genes supressores tumorais incluem mutações sem sentido, mutações de mudança de quadro e mutações no sítio de splicing principal, bem como deleções menos frequentes do códon de início, deleções do códon de parada e uma ampla gama de mutações de inserção/deleção de íntrons. Além disso, mutações missense e pequenas mutações de inserção/deleção de íntrons também podem levar à perda da atividade do gene supressor tumoral ao afetar domínios funcionais importantes. Variantes estruturais que levam à perda da atividade do gene supressor tumoral incluem deleções parciais ou completas do gene e outras variantes genômicas que levam à destruição do quadro de leitura do gene. Pequenas variantes que levam ao aumento da função dos oncogenes incluem mutações missense e inserções/deleções ocasionais de íntrons que têm como alvo domínios funcionais importantes de proteínas. Em casos raros, mutações de truncamento de proteínas ou de sítio de splicing podem levar à ativação de oncogenes. Variações estruturais que levam à ativação do oncogene incluem fusão gênica, deleção gênica e duplicação gênica.
A interpretação clínica da variação genômica avalia a significância clínica das mutações identificadas, ou seja, seu potencial valor diagnóstico, prognóstico ou terapêutico. Existem diversos sistemas de classificação baseados em evidências que podem ser usados ​​para orientar a interpretação clínica da variação genômica.
O Banco de Dados de Oncologia em Medicina de Precisão (OncoKB) do Memorial Sloan-Kettering Cancer Center classifica variantes genéticas em quatro níveis com base em seu valor preditivo para o uso de medicamentos: Nível 1/2, biomarcadores aprovados pela FDA ou clinicamente padronizados que preveem a resposta de uma indicação específica a um medicamento aprovado; Nível 3, biomarcadores aprovados ou não aprovados pela FDA que preveem a resposta a novos medicamentos direcionados que se mostraram promissores em ensaios clínicos; e Nível 4, biomarcadores não aprovados pela FDA que preveem a resposta a novos medicamentos direcionados que apresentaram evidências biológicas convincentes em ensaios clínicos. Um quinto subgrupo associado à resistência ao tratamento foi adicionado.
As diretrizes da Sociedade Americana de Patologia Molecular (AMP)/Sociedade Americana de Oncologia Clínica (ASCO)/Colégio de Patologistas Americanos (CAP) para a interpretação da variação somática dividem a variação somática em quatro categorias: Grau I, com forte significância clínica; Grau II, com potencial significância clínica; Grau III, significância clínica desconhecida; Grau IV, clinicamente não reconhecida. Apenas as variantes de grau I e II são valiosas para decisões terapêuticas.
A Escala de Operabilidade Clínica de Alvos Moleculares (ESCAT) da ESMO classifica variantes genéticas em seis níveis: Nível I, alvos adequados para uso rotineiro; Fase II, um alvo que ainda está sendo estudado, provavelmente será usado para rastrear a população de pacientes que poderia se beneficiar do medicamento alvo, mas mais dados são necessários para comprová-lo. Grau III, variantes genéticas alvo que demonstraram benefício clínico em outras espécies de câncer; Grau IV, apenas variantes genéticas alvo apoiadas por evidências pré-clínicas; Grau V, há evidências que comprovam a significância clínica do direcionamento da mutação, mas a terapia com um único medicamento contra o alvo não prolonga a sobrevida, ou uma estratégia de tratamento combinada pode ser adotada; Grau X, falta de valor clínico.